Grupo de Pesquisa NanoNeuroBioFísica

GRUPO DE PESQUISA NANONEUROBIOFÍSICA

  • Linhas de Pesquisa



  • Microscopia de Força Atômica – AFM


    A técnica de Microscopia de Força Atômica desenvolvida em 1986 por Binning, Quate e Gerber permite a realização de mapameamento de superfícies em escala atômica (nanocaracterização), e a realização de experimentos de reconhecimento molecular e das forças envolvidas nestes eventos. Além disso tem a possibilidade de trabalhar em meio liquido, e em condições fisiológicas, possibilitando sua aplicação em processos biológicos envolvendo vários tipos de amostras, incluindo proteínas, antígeno-anticorpo, DNA, RNA, lipídios, carboidratos e complexos moleculares.


    Figura 1: Miscroscópio de Força Atômica


    Referências: Binnig, G. et al. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters 56 (9), 930-933 (1986); Zhiefeng, S. et al. Biological atomic force microscopy: What is achieved and what is needed. Advances in Physics, London, 45, 1, (1996); Hansma, H. G. Surface Biology of DNA by Atomic Force Microscopy. Annual Review of Physical Chemistry, Stanford, 52, 71-92 (2003); Isralewitz, B. et al. Steered molecular dynamics and mechanical functions of proteins. Current Opinion in Structural Biology, London, 11, 224-230 (2001); Balashev, K. et al. Novel methods for studying lipids and lipases and their mutual interaction at interfaces. Part I. Atomic force microscopy. Biochimie, Paris, 83, 387-397 (2001); MarszaleK, P. E. et al. Fingerprinting polysaccharides with single-molecule atomic force microscopy. Nature Biotechnology, New York, v. 19, p. 258-262, 2001; Yang, Y. et al. Quantitative characterization of biomolecular assemblies and interactions using atomic force microscopy. Methods, 29, 175-187 (2003).

    1 - Nanocaracterização

    1.1 Caracterização de recobrimento de superficies

    O AFM é utilizado para confirmar a modificação química de pontas, cantilevers e substratos. O aumento na altura da amostra, devido o acrescimo de monocamadas confirma o sucesso da funcionalização.


    Figura 2: Imagens de AFM, apresentando a superfície de mica muscovita limpa (A), e as superfícies de micas funcionalizadas com APTES (B); com APTES e glutaraldeído (C), e com APTES, glutaraldeído e atrazina (D). É possível observar o aumento crescente de altura em nm com a adição de camadas em cada etapa da funcionalização.


    Referência: Moraes, A. S. et al. Evidências de detecção do herbicida atrazina por espectroscopia de força atômica: uma ferramenta promissora para sensoriamento ambiental. Acta Microscopica 24, 53-63 (2015).

    1.2 Caracterização de nanoestruturas

    O Microscópio de Força Atômica é utilizado na caracterização topográfica de uma grande variedade de materiais, proporcionando uma interessante técnica para o estudo de superfícies.


    Figura 3: Caracterização de lipossomas utilizando Microscópio de Força de Atômica.

    Referência: Camargo-Mascarenhas, R. P. et al. Development and characterization of liposomes containing glatiramer acetate for multiple sclerosis. International Journal of Applied Biology & Pharmaceutical Technology. Aceito para publicação

    2 - Medidas de reconhecimento molecular

    Nanobiossensores de AFM são utilizados para medir e mapear informações de reconhecimento molecular. Os nanossensores de AFM são extremamente versáteis, sendo encontrados na literatura nas mais diversas áreas. Nas pesquisas biomédicas, estão presente em estudos com células microbianas, proteínas, antígenos, interações biomoleculares, DNA, entre outros. Já em aplicações ambientais são utilizados na detecção de moléculas orgânicas e inorgânicas e monitoramento ambiental.

    Os sensores de AFM podem ser desenvolvidos utilizando cantilevers que possuem uma ponta em sua extremidade, e que nos da a informações da força de interação entre as moléculas através de uma curva de força, ou podem ser desenvolvidos utilizando o cantilever sem ponta, que após reconhecer a molécula de interesse sofre uma deflexão (encurvamento), ou apresenta uma mudança em sua frequência de ressonância. As principais vantagens dos nanobiossensores de AFM são principalmente relacionadas com os baixos limites de detecção e o reconhecimento específico.

    Referências: Garcia, P. S. et al. A Nanobiosensor Based on 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase Enzyme for Mesotrione Detection. IEEE Sens. J. 15, 2106–2113 (2015); Bueno, C. C. et al. Nanobiosensor for Diclofop Detection Based on Chemically Modified AFM Probes. IEEE Sens. J. 14, 1467–1475 (2014); Moraes, A. S. et al. Evidências de detecção do herbicida atrazina por espectroscopia de força atômica: uma ferramenta promissora para sensoriamento ambiental. Acta Microscópica - Interamerican Committee of Societies for Electron Microscopy. 24, 53-63 (2015).

    2.1 Sensores de pontas de AFM

    A curva de força revela a força de adesão entre a superfície de uma amostra e a ponta de cantilever. A curva de força exibe a deflexão do cantilever, no eixo y da curva, em função da distância entre a ponta e a amostra, no eixo x da curva. Os sensores de pontas de AFM detectam interações até da ordem de pN (PicoNewtons), sendo extremamente sensível na detecção de moléculas de interesse, como enzimas, herbicidas, antígeno, anticorpo, etc.

    Figura 4: Curva de força vs. distância e o comportamento do cantilever. A linha vermelha representa a curva de aproximação e a azul, a curva de retração. As letras A, B, C e D e S são acompanhadas de uma demonstração do comportamento do cantilever em cada nível de aproximação ou retração. A linha verde corresponde ao ponto fixo de deflexão controlado pelo sistema de retroalimentação (feedback). Adaptado de Braga e Ricci, 2004.

    Referências: Garcia, P. S. et al. A Nanobiosensor Based on 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase Enzyme for Mesotrione Detection. IEEE Sens. J. 15, 2106–2113 (2015); Bueno, C. C. et al. Nanobiosensor for Diclofop Detection Based on Chemically Modified AFM Probes. IEEE Sens. J. 14, 1467–1475 (2014); Moraes, A. S. et al. Evidências de detecção do herbicida atrazina por espectroscopia de força atômica: uma ferramenta promissora para sensoriamento ambiental. Acta Microscópica - Interamerican Committee of Societies for Electron Microscopy. 24, 53-63 (2015). Braga P.C. et al. How the Atomic Force Microscope Works. In.______. (Eds.). Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications. Totowa, NJ: Humana Press, 3 – 12 (2004).

    2.2 Sensores de hastes de AFM

    Nanossensores de cantilevers de AFM quando em contato com moléculas de interesse apresentam uma deflexão, que corresponde a um stress tensional da superficie do cantilever em função das variações das ligações químicas que determinam o arranjo estrutural das biomoléculas.

    Figura 5: Esquema representativo da deflexão do cantilever após a ligação das moléculas de reconhecimento específico.


    Referência: Fritz, J.; Cantilever biossensors. The Analyst, 133, 855-863 (2008).

    3 - Funcionalização de superficies

    A funcionalização consiste em uma modificação química ou biológica nas pontas e cantilevers de AFM. O revestimento ou funcionalização de um sensor é um passo de preparação crítico, porque a camada de revestimento vai definir a aplicação e o desempenho do sensor. Um dos maiores desafios nesse processo é adaptar o revestimento do biossesor de modo que as biomoléculas fiquem firmemente ligadas à superfície do sensor, mas que ainda permaneça funcional como no seu ambiente natural.

    Figura 6: Cantilever e ponta de AFM funcionalizadas.

    Referências: Garcia, P. S. et al. A Nanobiosensor Based on 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase Enzyme for Mesotrione Detection. IEEE Sens. J. 15, 2106–2113 (2015); Bueno, C. C. et al. Nanobiosensor for Diclofop Detection Based on Chemically Modified AFM Probes. IEEE Sens. J. 14, 1467–1475 (2014); Noy, A. et al. Chemical force microscopy. Annual Review of Materials Science, 27, 381-421 (1997).



    Nanobiossensores de nanopartículas



    As nanopartículas metálicas, principalmente de ouro e prata, são uma importante categoria de nanomateriais, devido as suas propriedades físicas, ópticas, elétricas e magnéticas determinadas dentro da nanoescala. Nesta dimensão, o biossensoriamento é possibilitado pelo aumento da área superficial das nanopartículas, o que aumenta a reatividade química com as biomoléculas. Elas ainda apresentam vantagens quando desenvolvidas para o biossensoriamento, uma vez que o processo de síntese é simples e de baixo custo. As AgNPs foram primeiramente aplicadas na detecção de aminoácidos pelo monitoramento da mudança de cor das suspensões e do padrão de absorção da ressonância plasmônica. No sistema imunológico, os antígenos são moléculas capazes de induzir a produção de anticorpos específicos. Essa especificidade pode ser explorada com o uso de nanobiossensores de dimensões aproximadas à essas moléculas, para promover o diagnóstico específico de diversas patologias. Assim, o desenvolvimento de métodos de detecção óptica por nanopartículas aplicadas à imunoensaios, visando o diagnóstico por meio do sensoriamento de marcadores específicos, tornam-se decisivos para a promoção de diagnósticos precoces de diversas imunopatologias, cujo foco principal do grupo são as doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla e a neuromielite óptica.



    Figura 7: Imagens de microscopia confocal a laser. (A) AgNPs não funcionalizadas; (B) área de interesse na figura A; (C) AgNPs funcionalizadas, sendo as representação em ciano as nanopartículas e em vermelho a proteína.



    Figura 8: Microtubos contendo nanopartículas. (A) nanopartículas não funcionalizadas; (B) nanopartículas funcionalizadas; (C) detecção do anticorpo específico pelas nanopartículas funcionalizadas.



    Referência: HIGA, A. M et al. Ag-nanoparticle-based nano-immunosensor for anti-glutathione-S-transferase detection. Biointerface Research in Applied Chemistry, 6, 1053-1058 (2016).



    Métodos em Química Computacional



    1 - Caracterização computacional do recobrimento de superfícies



    Reprodução computacional dos processos de adsorção envolvidos no recobrimento biológico durante métodos de funcionalização de superfícies. Modelos representativos para a superfície de pontas de AFM recobertas por biomoléculas são obtidos por métodos de modelagem e simulação computacional de forma a proporcionar a descrição em nanoescala do processo de imobilização de biomoléculas em superfícies, o arranjo molecular assumido numa superfície funcionalizada bem como das forças teóricas envolvidas na interação específica enzima-substrato, receptor-ligante ou antígeno-anticorpo.



    Figura 9: Representação do arranjo de moléculas da enzima Acetyl-CoA carboxilase e suas orientações em pontas de AFM funcionalizadas.



    Referências: Amarante, A. M. et al. Modeling the coverage of an AFM tip by enzymes and its application in nanobiosensors. J. Mol. Graph. Model. 53, 100–104 (2014); Oliveira, G. S. et al. Molecular modeling of enzyme attachment on AFM probes. J Mol Graph Model 45, 128–36 (2013).



    2 - Descrição de processos de interação e reconhecimento molecular



    Aplicação de técnicas computacionais avançadas para representação e estudo de eventos de interação intermolecular.

    2.1 Caracterização Estrutural de Biomoléculas

    Técnicas de modelagem computacional fundamentadas em dados experimentais disponíveis em repositórios especializados são aplicadas de forma a predizer e/ou refinar estruturas tridimensionais que descrevem biomoléculas tais como enzimas e anticorpos.



    Figura 10: Representação da estrutura tridimensional de biomoléculas. Na parte superior é evidenciado o processo de modelagem de alças, parte crítica na obtenção de estruturas tridimensionais por métodos computacionais. Na parte inferior são representados modelos tridimensionais para anticorpos do tipo imunoglobulina G (IgG).



    Referência: Ierich, J. C. M. et al. A Computational Protein Structure Refinement of the Yeast Acetohydroxyacid Synthase. J. Braz. Chem. Soc. 26, 1702–1709 (2015).



    2.2 Predição de Complexos Moleculares



    A orientação favorável de uma molécula em relação à outra quando estas formam um complexo estável pode ser descrita pela aplicação de métodos de docking molecular. Os cálculos computacionais envolvidos se baseiam na varredura da estrutura das moléculas e, com base em valores estimados de energia livre de ligação, é selecionada a conformação que melhor representa o complexo. Esta abordagem apresenta-se muito útil, por exemplo, na descrição de complexos enzimas-substratos e antígenos-anticorpos.



    Figura 11: Complexos biomoleculares descritos pela aplicação de métodos de docking molecular.



    Referências: Amarante, A. M. et al. in Nanociência & Nanotecnologia: Príncipios e Aplicações 2, 40–60 (Elsevier, 2014); Franca, E. F. et al. Designing an enzyme-based nanobiosensor using molecular modeling techniques. Phys Chem Chem Phys 13, 8894–9 (2011); Garcia, P. S. et al. A Nanobiosensor Based on 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase Enzyme for Mesotrione Detection. IEEE Sens. J. 15, 2106–2113 (2015);



    2.3 Estudo da dinâmica de biomoléculas e complexos biomoleculares



    A reprodução computacional da dinâmica de moléculas bem como complexos moleculares por meio de simulações tem se tornado um método padrão para o estudo do comportamento de sistemas biológicos, como proteínas, nanopartículas e ácidos nucleicos. Aferições acerca da estabilidade estrutural e da interação específica entre biomoléculas podem ser realizadas considerando a Física Clássica, onde funções de energia são utilizadas para a caracterização das forças e, consequentemente, do movimento dos átomos num biossistema. Detalhes sobre formação e quebra de ligações químicas bem como caracterização de propriedades eletrônicas estruturais e de interação entre proteína-ligante, enzima-substrato ou antígeno-anticorpo de forma mais aprofundada é possível pela aplicação de Métodos Híbridos de Mecânica Quântica e Mecânica Molecular (QM/MM).



    Figura 12: Potencialidades da simulação computacional. À esquerda uma caixa de simulação composta por moléculas de água, enzima Acetyl-CoA carboxilase e a superfície de silício. À esquerda é representada a ideia central do método híbrido de QM/MM, em que uma região específica é tratada considerando princípios da Quântica.

    Referências: Amarante, A. M. et al. in Nanociência & Nanotecnologia: Príncipios e Aplicações 2, 40–60 (Elsevier, 2014); Oliveira, G. S. et al. Molecular modeling of enzyme attachment on AFM probes. J Mol Graph Model 45, 128–36 (2013).

    2.4 Estudos de dinâmica molecular direcionada



    A força de interação teórica envolvida num complexo molecular e consequentemente a reprodução computacional dos experimentos envolvendo pontas funcionalizadas de AFM é proporcionada pela aplicação da dinâmica molecular direcionada (Steered Molecular Dynamics). Neste método, uma força é aplicada de forma a remover um ligante de um complexo com uma molécula receptora, o que permite a caracterização das forças envolvidas numa interação específica.



    Figura 13: Representação da aplicação de uma força para remoção de uma molécula ligante (herbicida diclofop) do complexo com a molécula receptora (enzima Acetil-CoA carboxilase).



    Referência: Amarante, A. M. et al. Modeling the coverage of an AFM tip by enzymes and its application in nanobiosensors. J. Mol. Graph. Model. 53, 100–104 (2014).



    3 Parametrização de moléculas em campos de força para simulações computacionais



    A realização de simulações computacionais considerando a Física Clássica (dinâmica molecular) é dependente da aplicação de campos de força para a reprodução dos movimentos dos átomos e, consequentemente, das biomoléculas como um todo. Um campo de força envolve parâmetros (funções de energia) para a descrição do comportamento de um biossistema em relação à energia potencial que descreve o mesmo. Estes parâmetros de campo de força podem ser derivados de cálculos de mecânica quântica, método empregado pelo grupo no caso de novas moléculas utilizadas como linkers durante o processo de funcionalização.



    Figura 14:Representação da molécula de herbicida diclofop associada ao linker (3-aminopropil)trietoxisilano. Para a simulação, os parâmetros de campo de força foram determinados com base em cálculos quânticos.



    Referência: Bueno, C. C. et al. Nanobiosensor for Diclofop Detection Based on Chemically Modified AFM Probes. IEEE Sens. J. 14, 1467–1475 (2014).



    4 Automação de protocolo por meio de algoritmos computacionais



    Elaboração de uma série de comandos baseados em linguagens de programação específicas de forma a gerar scripts computacionais capazes de auxiliar em tarefas laboratoriais como: (i) construção de inputs para simulação; (ii) interpretação de resultados computacionais e de curva de força; (iii) caracterização do arranjo de biomoléculas imobilizadas em superfície; e (iv) determinação de concentrações a serem aplicadas durante processos de funcionalização.



    Figura 15:Aplicação de linguagem de programação para a automação de tarefas laboratoriais.



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